Координатор: канд. хим. наук Зенкова М. А.
Исполнители: НИБХ, ИЦГ СО РАН
Исследованы способности олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам мРНК mdr1, снижать ее количество в культуре клеток линии КВ-8-5, имеющих в 6—8 раз повышенный уровень экспрессии этой мРНК по сравнению с родительской линией КВ-3-1. Обнаружено, что конъюгаты олигонуклеотидов, несущие биспиренильные и аминопропильные группы на 5’ и 3’ концах, соответственно, комплементарные участку 319-333 кодирующей области и участкам 150-165 и 122-137 в области AUG кодона, снижают уровень экспрессии mdr1 мРНК в клетках на 90, 50 и 40 % соответственно (рис. 1). Олигонуклеотиды, не способные гибридизоваться с mdr1 РНК in vitro, не влияют на уровень mdr1 РНК в клетках. Идентифицирован перспективный олигонуклеотид, комплементарный участку 319-333 mdr1 мРНК, модифицированные аналоги которого могут быть использованы для обращения фенотипа PgP/mdr in vivo.
Рис. 1. Ингибирование экспрессии mdr1 мРНК в клетках КВ-8-5 антисмысловыми олигонуклеотидами (ордината). Уровень экспрессии mdr1 мРНК в контрольных клетках принят за 100 %. Fig. 1. Inhibition of mdr1 mRNA expression by 5'-bis-pyrenyl-3'-aminohexyl antisense oligonucleotide conjugates in KB-8-5 cells as estimated by RT-PCR. 100 % corresponds to the mdr1 mRNA level in the control untreated cells. |
Исследована возможность подавления экспрессии гена mdr1 в клетках линии KB-8-5 с помощью синтетических 21-звенных двуцепочечных олигорибонуклеотидов. В присутствии олигонуклеотидной конструкции siE, комплементарной району 315—335 мРНК, в концентрациях выше 5 нм в клетках наблюдается полное исчезновение мРНК mdr1(рис. 2). Исследование кинетики процесса показало, что снижение уровня mdr1 мРНК происходит после 16—18 ч инкубации в присутствии олигонуклеотида и через 24 ч детектируется минимальный уровень мРНК mdr1, после чего снижение концентрации mdr1 мРНК наблюдается в клетках в течение еще по крайней мере трех суток. Олигонуклеотид siI, гомологичный последовательности интрона и не имеющий мишени в составе мРНК, в концентрациях 5—50 нм не влиял на уровень mdr1 мРНК в клетках.
Рис. 2. Ингибирование экспрессии гена mdr1 в клетках KB-8-5 с помощью siРНК. Данные RT-PCR-анализа. Fig. 2. Inhibition of mdr1 mRNA expression by siRNA in KB-8-5 cells as estimated by RT-PCR. |
Антисенс-технология обладает достоинством избирательного угнетения экспрессии гена в определенной группе клеток, на которые антисмысловой олигонуклеотид может быть локально апплицирован. В наших опытах введенный в область синего пятна ствола головного мозга взрослых крыс антисмысловой олигонуклеотид к мРНК альфа2А-адренорецептора специфически снижал уровень этой мРНК, определенный методом RT-PCR, а также ингибировал оцененную радиолигандным методом экспрессию рецепторного белка в этом отделе мозга (рис. 3).
Таким образом, проведено комплексное исследование подавления экспрессии гена мишени в культуре раковых клеток и в животных с помощью производных олигонуклеотидов различной природы. Показано, что применение антисмысловых олигонуклеотидов, их модифицированных аналогов и коротких РНК-дуплексов (siРНК) приводит к специфическому снижению уровня целевых мРНК в культуре клеток и у лабораторных животных.
Рис. 3. Подавление экспрессии гена альфа2а-адренорецептора (Alpha2A-AR) антисмысловым олигонуклеотидом в развивающемся головном мозге крыс, оцененное РТ-ПЦР. Снизу — уровень экспрессии гена b-актина, использованный в качестве внутреннего стандарта при анализе уровня экспресии гена альфа2-адренорецептора. SAL — физиологический раствор (дорожки 1 и 2); RANDOM — случайный олигонуклеотид (дорожки 3—6); ANTISENSE — олигонуклеотид, комплементарный мРНК гена альфа2а-адренорецептора (дорожки 7—12). Fig. 3. Down-regulation of alpha2-adrenoreceptor gene (Alpha2A-AR) with antisense oligonucleotides in the brains of newborn rats as assayed by RT-PCR. The level of b-actin expression used as internal standard is shown at the bottom. SAL — physiological solution, control, lanes 1—2; RANDOM — scrambled oligonucleotide, lanes 3—6; ANTISENSE — oligonucleotide complementary to alpha2-adrenoreceptor mRNA, lanes 7—12. |
Список основных публикаций
В оглавление | Далее |