Координатор: д-р мед. наук Глушков А. Н.
Исполнители: отдел иммунологии рака КемНЦ, НИБХ СО РАН, КГМА
С целью создания средств защиты человека и животных от влияния низкомолекулярных органических соединений генотоксического действия с использованием антител разработан способ синтеза конъюгатов белков с полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), хорошо растворимых в воде, устойчивых без специальных стабилизаторов и содержащих минимальные количества полимерных продуктов, с заданным соотношением 10 ± 1 моль ПАУ на моль белка. Такое молярное соотношение гаптен—носитель является оптимальным для получения антител (AT) к гаптену.
Реакцию белка с ПАУ, имеющим альдегидную группу, проводили в щелочном растворе, а стабилизацию конъюгата достигали восстановлением боргидридом натрия в присутствии соединения, блокирующего образование нерастворимой полимерной фракции. Продемонстрирована эффективность полученных конъюгатов для получения и иммуноферментного анализа антител к ПАУ на примере бензо[а]пирена, антрацена, бензантрацена, пирена, хризена. Для иммунизации кроликов использовали конъюгаты ПАУ с бычьим сывороточным альбумином, а для иммуноанализа искомых АТ — конъюгаты соответствующих ПАУ с дрожжевой гексокиназой.
Использование альдегидов ПАУ для синтеза конъюгатов с белками позволило достичь хороших результатов в иммунизации животных — получены сыворотки с высокими титрами AT к ПАУ.
Разработаны новые подходы к синтезу аффинных сорбентов, содержащих ПАУ, с различными комбинациями матрикса и характера (длины) спейсера. Наиболее удобными в техническом исполнении и эффективными в выделении высокоощищенных АТ-ПАУ оказались сорбенты на основе бромцианактивированных сефароз 4В и 6В с иммобилизованными на них конъюгатами гексокиназы с ПАУ, в котором ароматическое ядро (гаптен) удалено от матрикса шестиатомной спейсерной группой.
Общий выход биологического материала, связывающегося с данными сорбентами, составлял от 56 мкг до 1,2 мг белка из 1 мл полученных поликлональных антисывороток.
Специфичность выделенных таким образом АТ определяли с помощью конкурентного иммуноферментного анализа. Установлено, что гексокиназа без гаптенов (контроль) не конкурирует с АТ за связывание ни с одним из конъюгатов ПАУ-гексокиназа. Это еще раз подтверждает правильность выбранной нами схемы получения и исследования АТ, когда для иммунизации в качестве макроносителя используется бычий сывороточный альбумин, а при аффинной хроматографии и в иммуноанализе в качестве спейсера и носителя соответственно используется гексокиназа. В результате удалось выделить искомые АТ, моноспецифические к каждому из пяти ПАУ. Специфичность наиболее выражена в случаях с АТ к антрацену и к пирену, где перекрестные реакции с другими ПАУ практически отсутствуют. Но и в случаях с АТ к бензантрацену, бензпирену и хризену сила их связывания соответственно с бензантраценом, бензпиреном, хризеном как минимум на порядок выше, чем со всеми другими ПАУ.
Таким образом, применение известного ранее приема: иммунизация гаптеном на основе одного белка-носителя и последующее выделение и выявление антител к этому же гаптену на основе другого белка-носителя, оказалось высокоэффективным для анализа AT к ПАУ. Разработанный нами подход можно использовать как метод выбора в синтезе конъюгатов ПАУ—белок для получения и анализа AT к ПАУ.
При выполнении настоящего проекта создана аналитическая база и синтезированы исходные материалы для получения антиПАУ-вакцин, трансгенных растений и микроорганизмов с антиПАУ-свойствами, а также вакцин для иммунотерапии лейкозов, индуцированных ПАУ. Обоснована биотехнология получения средств защиты человека и животных от низкомолекулярных органических соединений (см. рисунок).
 |
|
Биотехнология получения средств защиты человека и животных от низкомолекулярных органических соединений (НМС) с использованием антител (АТ). Figure. Biotechnological approach to development of protective antibodies against small organic molecules. General production scheme. |
Список основных публикаций
 В оглавление |
Далее 
|