ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

В Институте цитологии и генетики на основе использования хромосом-специфических библиотек человека, кошки, американской норки, лисицы и собаки проведено детальное реципрокное сравнение геномов этих видов (рис. 4.1). Получены полные интеграционные карты хромосом у перечисленных видов.

Впервые разработан компьютерный метод вычисления нуклеосомного потенциала ДНК, характеризующего ее способность к формированию нуклеосомы (рис. 4.2). С его использованием проведено систематическое исследование нуклеосомного уровня организации хроматина геномов различных видов эукариот. Изучали профиль нуклеосомного потенциала для промоторов генов человека с качественно различающимся характером экспрессии: тканеспецифичных; экспрессирующихся в широком кругу тканей; генов "домашнего хозяйства". Средние профили нуклеосомного потенциала для промоторов трех групп генов приведены на рис. 4.2. Оказалось, что нуклеосомный потенциал во всех трех группах генов уменьшается по мере приближения к старту транскрипции. Между профилями для трех групп промоторов имеются существенные различия: наиболее высокие значения наблюдаются для промоторов тканеспецифичных генов, более низкие значения – для промоторов генов, экспрессирующихся в широком кругу тканей, наконец для промоторов генов "домашнего хозяйства" наблюдаются самые низкие значения. Таким образом выявлены основы контекстно-конформационного кода нуклеосомного уровня организации хроматина эукариот.

В рамках проекта "Моделирование фундаментальных генетических процессов и систем" (научные руководители – д-р биол. наук Н.А. Колчанов, чл.-корр. РАН С.С. Гончаров) с участием ИЦГ, ИМ, ИВТ, ИВМиМГ, ИТФ и МТЦ осуществлялось исследование фундаментальных молекулярно-генетических систем и процессов с использованием методов компьютерного анализа и моделирования. Для описания генных сетей разработана база данных GeneNet через Интернет (http//wwwmgs.bionet.nsc.ru/systems/mgl/genenet/). GeneNet позволяет формализовать разнообразную информацию о структурно-функциональной организации генных сетей, выделить элементарные компоненты и взаимодействия, а также представить информацию пользователю в графическом виде. В настоящее время в GeneNet содержится информация о 23 генных сетях – в семи тематических разделах.

Разработан метод моделирования динамики генных сетей, основанный на блочном подходе. Согласно этому методу исходная система расчленяется на элементарные подсистемы, описываемые независимо друг от друга. В настоящий момент разрабатываются модели двух генных сетей: регуляции и созревания эритроцита и регуляции внутриклеточного биосинтеза холестерина (рис. 4.3).

Сотрудниками Института цитологии и генетики разработан новый противотуберкулезный препарат "Изодекс", представляющий собой изониазид, иммобилизованный на радиационно-активированном декстране (рис. 4.4). "Изодекс" предназначен для высокоэффективной терапии туберкулеза легких. Особенностью разработанного препарата является низкая токсичность в сочетании с пролонгированным противотуберкулезным действием. В настоящее время препарат находится на стадии доклинических исследований, направленных на подготовку НТД для представления препарата в Фармакологический комитет РФ. Способ получения "Изодекса" защищен патентом России.

Сотрудниками Новосибирского института биоорганической химии СО РАН охарактеризованы мутации гена rpoB в 45 клинических изолятах M. tuberculosis, распространенных в Сибирском регионе и резистентных к действию антитуберкулезного препарата рифампицина. В этих изолятах обнаружена 41 мутация восьми разновидностей, подсчитана частота их встречаемости. Показана возможность применения разработанных методов типирования для молекулярно-эпидемиологических исследований изолятов M. tuberculosis. Проведен кластерный анализ 27 рифампицин-устойчивых изолятов M. tuberculosis. Представленные данные позволяют заключить, что среди жителей города Новосибирска циркулируют близкородственные штаммы M. tuberculosis, имеющие высокий коэффициент отличия от стандартного штамма H37RV (рис. 4.5), а также от штаммов европейского происхождения.

В том же Институте впервые осуществлена разборка 40S субчастицы рибосом человека на 18S рРНК и белки. Определена последовательность отщепления рибосомных белков от субчастицы при возрастающей концентрации моновалентных катионов (рис. 4.6). Найдены белки (S7, S10, S16 и S19), наиболее прочно связанные с 18S рРНК (находящиеся внутри 40S субчастицы). Показано, что рибосомы человека гораздо более чувствительны к действию моновалентных катионов по сравнению с бактериальными рибосомами, что свидетельствует о более слабом удерживании рибосомных белков на 18S рРНК в 40S субчастице и, следовательно, о более сложном пути сборки рибосомных субчастиц в клетках млекопитающих по сравнению с клетками бактерий.

Учеными этого же Института детально исследована динамика структурных изменений РНК при взаимодействии с олигонуклеотидами. Показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является двустадийным (рис. 4.7). Первая, быстрая стадия заключается в нуклеации с образованием промежуточного метастабильного комплекса с одноцепочечным участком РНК. Вторая, лимитирующая стадия представляет собой внутримолекулярную перегруппировку пространственной структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса. Данный конформационный переход является медленным и определяется прочностью разворачиваемого участка РНК. Определены кинетические и термодинамические закономерности комплексообразования, что позволяет целенаправленно создавать "ингибиторы" биологически активных РНК, в частности вирусных.

В рамках интеграционного проекта "Разработка новых принципов конструирования материалов и систем детекции для создания высокочувствительных приборов и методов для манипулирования биополимерами и медицинской диагностики" (научный координатор – академик В.В. Власов) сотрудниками НИБХ, ИХХТ, ИАиЭ, КТИ ПМ СО РАН и ТИБОХ ДВО РАН разработан и подготовлен опытный образец поляризационного сенсора, предназначенного для детекции комплексов, образующихся между комплементарными фрагментами ДНК, один из которых иммобилизован на поверхности стекла (рис. 4.8). С помощью сенсора можно измерять показатель преломления на границе "твердый носитель – раствор", изменяющийся в процессе адсорбции комплементарной цепи. Комплексообразование ДНК из раствора с иммобилизованным на поверхности фрагментом ДНК приводит к значительному изменению показателя преломления. Образовавшийся комплекс может быть разрушен путем повышения температуры и промывки системы. Это позволяет проводить на поверхности сенсора повторную гибридизацию. Показано, что на одном стеклянном элементе с иммобилизованным фрагментом ДНК можно проводить не менее 15 циклов гибридизации без существенного уменьшения величины изменения показателей преломления. Сенсор обеспечивает высокую чувствительность детекции и имеет простую конструкцию, обеспечивающую низкую стоимость изготовления прибора. Существенная разница в показаниях сенсора ( D ~ 900 mv) наблюдается только при добавлении комплементарного олигонуклеотида, что свидетельствует об адсорбции его на поверхности призмы, т.е. об образовании специфического комплекса.

Учеными Сибирского института физиологии и биохимии растений получен ряд новых трансгенных растений: пшеницы, томата, огурца, картофеля, осины и др., отличающихся измененным гормональным статусом, повышенной энергией роста и увеличенной урожайностью (рис. 4.9). В растения введены: ген ugt, выделенный из кукурузы, кодирующий УДФГ-трансферазу, ген acp – кодирующий синтез ацилпереносящего белка, выделенный из арабидопсиса. Урожайность: картофеля – до 4 кг с куста (на 60–80 % выше контроля), томата – до 46 кг с кв. м (на 80–90 % выше контроля), огурца – до 21,1 кг с кв. м (на 40–65 % выше контроля). Осина выявила значительное ускорение роста, растения высажены в грунт для дальнейшего наблюдения. У полученных трансгенных растений картофеля, томата, рапса и осины подтверждена методом ПЦР и блоттингом по Саузерну интеграция в их геном целевых генов ugt и acb, кодирующих синтез УДФГ-трансферазы и ацилпереносящего белка, которые и обусловливают ускорение роста и повышение урожайности трансгенов.

В этом же Институте в исследованиях структуры, организации и экспрессии митохондриального генома растений с целью разработки принципов его направленного изменения впервые определены нуклеотидные последовательности двух фрагментов генов coxIII (232 и 270 п.н.) и atpA (314 и 338 п.н.) в составе митохондриального генома многолетнего дикорастущего злака Elymus sibiricus, являющегося потенциальным донором хозяйственно ценных признаков митохондриального кодирования (рис. 4.10). Выявлены три нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в кодируемом белке – во втором фрагменте гена coxIII E. sibiricus по сравнению с соответствующим участком гена Triticum aestivum. В исследовании роли редактирования РНК в экспрессии митохондриальных генов растений получена кДНК транскрипта coxIII E. sibiricus и клонирована в векторе pTZ18R в виде полноразмерной копии и двух субфрагментов. Секвенирование с последующим анализом нуклеотидной последовательности одного из клонов, содержащего полноразмерную кДНК, показало полную гомологию этого участка с таковым гена coxIII пшеницы. Соответствующие последовательности митохондриальных генов зарегистрированы и помещены в Европейскую молекулярно-биологическую базу данных (EMBL Nucleotide Sequence Data Base, Accession Numbers AJ296099, AJ296100, AJ295020, AJ291297).

В Институте цитологии и генетики получены две трисомные линии гороха с 15 хромосомами, производящие в ходе самоопыления исключительно трисомиков. Эти линии имеют в качестве экстрахромосомы маленькую обменную хромосому, составленную из коротких плеч хромосом 6 и 3 (рис. 4.11). Добавочную хромосому можно использовать как инструмент для хромосомной и генной инженерии.

В этом же Институте получены новые препараты биологически активных веществ (БАВ), представляющие собой смесь тритерпеновых кислот, цембранов и других соединений, экстрагированных из древесной зелени растений хвойных пород. Представителями этого класса соединений являются "Силк" и его аналоги. Воздействие данными препаратами повышает устойчивость растений к фитопатогенам, температурным стрессам, существенно увеличивает урожайность и качество продукции (рис. 4.12). По двум новым препаратам БАВ проводится подготовка к государственным испытаниям. Их основные достоинства состоят в том, что они "подавляют" развитие твердой головни пшеницы, пузырчатой головни кукурузы и ряда других болезней растений, а также повышают класс и группу зерна. Полученные препараты повышают иммунитет растений к этим заболеваниям, что не удается получить, используя препарат "Силк".

В Институте биофизики впервые получены кристаллы рекомбинантного Ca²⁺ – регулируемого фотопротеина обелина из морского биолюминесцирующего гидроида Obelia longissima, пригодные для рентгено-структурного анализа. На основе ранее предсказанной теоретической модели определена пространственная структура белка с разрешением 1,7 A (рис. 4.13). Показано, что структура молекулы представляет собой компактную глобулу с радиусом приблизительно 25 A. Структура обелина сформирована восемью a-спиралями, организованными в симметричные относительно друг друга N- и C-концевые домены. Образно N- и C-концевые домены могут быть представлены как две "чашки", внутреннюю поверхность которых образуют гидрофобные аминокислотные остатки. Внутри гидрофобной полости, образованной N- и C-концевыми доменами, локализован целентеразин – субстрат биолюминисцентной реакции фотопротеинов. Показано, что субстрат связан в форме целентеразин гидрата и не образует ковалентной связи с белком. Пространственная структура обелина решена совместно с Университетом штата Джорджия (США).

В этом же Институте, с целью исследования механизма развития синезеленых водорослей, на основе полевых наблюдений и лабораторных экспериментальных данных создана теоретическая модель непрерывного вертикального распределения биологических, химических и гидрофизических компонентов экосистемы оз. Шира. В этой связи строго теоретически показано, что в нестратифицированных условиях световой механизм регуляции роста формирует устойчивый пик глубинного "цветения" синезеленых микроводорослей. Расчетная глубина (10-11 м) расположения пика совпадает с наблюдаемой (рис. 4.14-1а, 2а). Фотоэнергетический механизм заглубленного "цветения" исследован впервые и составляет основу моделирования всего трофического каскада водной экосистемы. Обнаружена корреляция между расчетными данными по продукции кислорода и его распределения в толще воды озера (рис. 4.14-1б, 2б).

В Институте вычислительного моделирования на основе теоретических и экспериментальных исследований процессов фотосинтетического продуцирования в водных экосистемах качественно и количественно показано, что удельная поверхность клеток фитопланктона является одним из определяющих факторов его продуктивности, поскольку отношение площади поверхности клеток фитопланктона к единице их биомассы определяет ассимиляционную активность водорослей (рис. 4.15). Впервые разработана модель зависимости удельной продукции фитопланктонного сообщества от обобщенного структурного параметра, учитывающего этот фактор. Модель позволяет оценивать первичную продукцию фитопланктона по дисперсной структуре сообщества независимо от видового и возрастного состава.

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ

В Институте леса им. В.Н. Сукачева на основе созданных локальных баз данных повыдельных характеристик древостоев и их расчетного климата разработаны биоклиматические модели локального уровня – многофакторные регрессионные уравнения, связывающие состав, бонитет, запас и тип леса с климатическими индексами в горах Южной Сибири. С использованием ГИС-технологий по локальным моделям восстановлен состав коренных лесов и их продуктивность в зависимости от распределения климатических показателей на модельных профилях. Локальные биоклиматические модели могут использоваться для оценок изменений в древостоях под влиянием изменений климата (рис. 4.16).

В том же Институте с помощью методов низкотемпературного термического анализа исследовались фазовые превращения воды вегетативных органов морозостойкой лиственницы сибирской и некоторых древесных растений – интродуцентов. Установлены количественные показатели, по которым можно судить о морозостойкости органов и тканей зимующих растений (рис. 4.17):
– температура начала кристаллизации переохлажденной внутриклеточной воды (низкотемпературная экзотерма – НТЭ), определяющая температурную границу устойчивости (рис. 4.17, А);
– величина скорости охлаждения, при которой достигается наименьшая температура и обеспечивается своевременный отток воды из живых клеток в зону безопасного льдообразования;
– количество льда, образующегося в тканях растения при охлаждении до ~ -30 °С, когда замерзает не более 64-66 % воды, способной кристаллизоваться (рис. 4.17, Б).

По этим характеристикам растений-интродуцентов уже на начальном этапе интродукции можно осуществлять целенаправленный отбор морозостойких видов.

Учеными этого же Института впервые определены запасы лабильного органического вещества на поверхности и в почве, интенсивность отмирания и разложения древесных фракций в лиственничниках северной тайги (вдоль Енисейского трансекта). Оценены константы скорости разложения отпада и опада: для хвои лиственницы и кедра 0,37-0,39 год^-1, для мха – 0,13 год^-1, для ветвей, коры и шишек – 0,03-0,045 год^-1, для лишайников – 0,02 и для древесины стволов – 0,004-0,005 год^-1 (рис. 4.18).

В Институте почвоведения и агрохимии разработана концепция непрерывного почвообразования в плейстоцене, согласно которой всю толщу плейстоценовых отложений на территориях, не подверженных активным тектоническим преобразованиям, следует рассматривать как непрерывную череду последовательно сменяющихся почвенных профилей, по свойствам материала которых можно проводить стратиграфические корреляции и палеоэкологические реконструкции. Наиболее глубокая переработка материала осуществлялась в относительно гумидные и теплые фазы (вторичное оглинивание, утяжеление гранулометрического состава, накопление гумусовых веществ). В сухие фазы эти процессы проявлялись очень слабо, иногда отсутствовали, как это свойственно почвам современных пустынь и полупустынь (рис. 4.19).

В том же Институте установлена региональная специфика элементного химического состава почв Западной Сибири, заключающаяся в повышенном, сравнительно с почвами Русской равнины, содержании As, Mo, Zn, Cu, V, Mn, Sr, Be, Tl и пониженном – Ba, Co, Cr, Y, Yb, Zr (рис. 4.20). Валовое содержание микроэлементов в почвах и почвообразующих породах выполнено количественно атомно-эмиссионным методом с использованием в качестве источника эмиссии спектров дугового аргонового двухструйного плазмотрона. Фотографическая регистрация спектров осуществлялась на двух скрещенных спектрографах. Для построения калибровочных кривых и контроля точности измерений использовали государственные стандартные образцы. Исследования убедительно доказали ошибочность привлечения в качестве фоновых значений для мониторинга природной среды и иных экологических целей показателей глобального уровня (кларки химических элементов в почвах Мира, континента, страны), поскольку они не способны учесть специфику литохимии почв регионов и местного почвообразования. Определены и предложены как основа мониторинга региональные фоновые содержания 22 химических элементов в почвах Западной Сибири, наиболее подверженных антропогенному влиянию.

В Центральном сибирском ботаническом саду выявлены закономерности пространственного разнообразия флоры сосудистых растений в регионе Азиатской России и более детально – в регионе Байкальской Сибири, Тувы и Внешней Монголии. Разработаны схемы флористического районирования для этих регионов. Они основаны на моделировании с помощью кластерного анализа по методу Уорда. Такой подход приводит к более объективным оценкам в отличие от традиционных дивергентных схем. На основе учета видового и подвидового состава флоры в Азиатской России выделены 13 провинций в пределах Арктическо-Берингийской, Бореальной и Восточноазиатской областей. Предложенные оригинальные схемы флористического деления дают синоптическое (зрительное) представление о таксономическом разнообразии и могут быть использованы как научная основа в вопросах рационального использования и охраны биологических ресурсов (рис. 4.21).

В этом же Институте создана база данных геоботанических описаний типологического разнообразия степной зоны Азиатской России. Разработаны алгоритмы, реализованные в компьютерных программах, позволяющие проводить выделение корреляционных плеяд видов растений, маркирующих основные зонально-поясные и эдафические подтипы степной растительности. Разработана система эколого-ценотических элементов степной флоры гор Южной Сибири и система эколого-флористической классификации степей Центральной Азии с охватом сопредельных территорий Сибири (Алтае-Саянская горная область и Забайкалье). Типологическое разнообразие степных сообществ представлено четырьмя классами, объединяющими более 25 ассоциаций, представляющих основное разнообразие степных сообществ. Для видов степной флоры разработаны экологические шкалы по увлажнению и засолению почв, с использованием шкал проведена ординация степных сообществ (рис. 4.22).

В том же Институте издан полный атлас крупного семейства Ивовых, представленного видами родов Ива (68 видов), Тополь (5 видов) и Чозения (1 вид), произрастающих в Сибири. В атласе показано видовое разнообразие Ивы в разных регионах Сибири: Западно-Сибирская равнина – от 5 до 15 видов, между реками Енисей и Лена – до 20 видов. Наибольшее разнообразие отмечается в горах Алтая, Саян и на Витимском плоскогорье. Жизненные формы ивы представлены кустарниками и кустарничками, немного видов представлено деревьями кустарникового типа (рис. 4.23).

В Сибирском институте физиологии и биохимии растений создана база данных "Редкие и исчезающие растения и сообщества Селенгинского Прибайкалья" и получено свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ "Селенга" (№ 2000620077). В данной геоинформационной системе (ГИС) обобщены сведения о редких растениях и уникальных растительных сообществах центральной зоны Участка Всемирного Природного Наследия. ГИС содержит подробные данные о 114 видах уникальных растений и 30 растительных сообществах.

Институтом общей и экспериментальной биологии подведены итоги изучения таксономического разнообразия флоры Бурятии. Установлено, что на территории республики насчитывается 2129 видов и подвидов сосудистых растений. Разработана функциональная типология редких видов растений, нуждающихся в охране (рис. 4.24).

В Институте систематики и экологии животных совместно с Институтом геологии, геофизики и минералогии реконструирована четвертичная история формирования фауны бабочек-медведиц широколиственных лесов Палеарктики (рис. 4.25). Фаунистические миграции чешуекрылых происходили большей частью с востока на запад в климатический оптимум голоцена (рис. 4.25, А), а современные ареалы бабочек образовались совсем недавно – в суббореальное время голоцена при похолодании около 6 тыс. лет назад (рис. 4.25, Б), а не в начале плейстоцена – 1 млн лет назад, как считалось ранее.

Рис. 4.25. Географические ареалы и направления миграции бабочек, связанных с широколиственными лесами.

Сотрудники Института систематики и экологии животных для системы "насекомые – паразиты леса и поражающие их вирусы" впервые показали циклические изменения вирусов, сопряженные с популяционными циклами хозяев. Полиморфизм популяций вируса ядерного полиэдроза увеличивается по мере развития вспышки массового размножения насекомых, и одновременно снижается устойчивость хозяев к вирусной инфекции. Это позволяет выделять оптимальные фазы цикла для поиска новых штаммов вируса, обладающего высокой инсектицидной активностью (рис. 4.26).

Мониторинговые наблюдения взаимосвязи экологии паразитов с экологией промежуточных и дефинитивных хозяев впервые позволили Институту общей и экспериментальной биологии установить приуроченность жгутиконосцев рода Trypanosoma к рыбам сибирского комплекса оз. Байкал, а рода Cryptobia – к байкальскому (рис. 4.27). Соответственно частота встречаемости трипаносом уменьшается с глубиной от литорали к профундали, а криптобий – увеличивается, поскольку большинство новых видов этого рода являются специфичными паразитами крови эндемичных глубоководных рогатковидных рыб. Это позволяет вскрыть механизмы сопряженной эволюции паразитов и хозяев и процесса видообразования.

Рис. 4.26. Изменение полиморфизма вируса и чувствительности насекомых к вирусу в различные фазы популяционного цикла непарного шелкопряда.		Рис. 4.27. Зараженность рыб Байкала различных фаунистических комплексов кровепаразитами родов Trypanosoma и Cryptobia.

Институтом биологических проблем криолитозоны наземными и космическими методами мониторинговых наблюдений установлено, что восточная популяция стерха на территориях гнездования и летнего обитания представлена на 85-90 % сформировавшимися парами. Установлена их жесткая привязанность к выбранной территории. Площадь участка каждой пары зависит от качественного состава местообитания и возраста птиц. В оптимальных местах гнездования (16-33 % территории приходится на крупные озера), занимаемых потенциально репродуктивными парами (птицы старше 6-7 лет), гнездовья более компактны по площади, чем в местах с малым количеством больших озер, где стации представлены мозаично (рис. 4.28 и 4.29).

Рис. 4.28. Размеры и конфигурация гнездового участка стерха в оптимальных стациях (сторона сетки 2 км).		Рис. 4.29. Конфигурация и размер гнездового участка стерха на территории с мозаичным распределением оптимальных стаций.

Этим же Институтом дана оценка современного состояния антропогенных трансформаций аласно-таежных экосистем, занимающих около 30 % территории Якутии. Установлено, что высокая концентрация сельскохозяйственного производства и населения, а также сверхнормативное уничтожение главного средообразующего фактора – среднетаежных лесов – привели к нарушению естественного водного баланса территорий. Массовое высыхание озер и перманентный дефицит почвенной влаги привели к трансформации экосистем в низкопродуктивные. Масштабы сильной пастбищной дегрессии достигли 50-60 %. В результате снижения видового разнообразия флоры и фауны появились очаги антропогенного опустынивания (рис. 4.30).